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谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
注意:正式測(cè)定之前選擇預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
規(guī)格:100T/96S
產(chǎn)品內(nèi)容:
試劑一:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。試劑二:液體 22mL×1 瓶,4℃保存。
試劑三:粉劑×1 瓶,4℃保存。臨用前加 2 mL 蒸餾水溶解。
產(chǎn)品說(shuō)明:
微量法
GST 是一種具有多種生理功能的蛋白質(zhì)家族,主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。GST 是體內(nèi)解毒酶系統(tǒng)的重要組成部分,主要催化各種化學(xué)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物與 GSH 的巰基共價(jià)結(jié)合,使親電化合物變?yōu)橛H水物質(zhì),易于從膽汁或尿液中排泄,達(dá)到將體內(nèi)各種潛在或具備毒性的物質(zhì)降解并排出體外的目的。因此,GST 在保護(hù)細(xì)胞免受親電子化合物的損傷中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。此外,因?yàn)?GST 具有 GSH-Px 活性,亦稱(chēng)為 non-Se GSH-Px,具有修復(fù)氧化破壞的大分子如 DNA、蛋白質(zhì)等的功能。注意,GST 催化的反應(yīng)減少 GSH 含量,但是不增加 GSSG 含量。
GST 催化 GSH 與 CDNB 結(jié)合,其結(jié)合產(chǎn)物的光吸收峰波長(zhǎng)為 340nm;通過(guò)測(cè)定 340nm 波長(zhǎng)處吸光度上升速率,即可計(jì)算出 GST 活性。
自備儀器和用品:
低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔
UV 板和蒸餾水。
操作步驟:
一、粗酶液提取:
1.組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱(chēng)取約 0.1g 組織,加入 1mL
試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,4℃離心 10min,取上清置冰上待測(cè)。
2.細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):試劑一體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時(shí)間 3min);然后 8000g,4℃,離心 10min,取上清置于冰上待測(cè)。
3 .血清等液體:直接測(cè)定。二、測(cè)定:
1.分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 340 nm,用蒸餾水調(diào)零。
2.試劑二放在 25℃(一般物種)或者 37℃(哺乳動(dòng)物)保溫。
3.空白管:取微量石英比色皿,加入 20μL 試劑一,180μL 試劑二和 20μL 試劑三,迅速混勻后于
340nm 測(cè)定 10 s 吸光度記 A1,37℃水浴 5min 后,快速取出測(cè)定吸光度記 A2。
4.測(cè)定管:取微量石英比色皿,加入 20μL 上清液,180μL 試劑二和 20μL 試劑三,迅速混勻后于
340nm 測(cè)定 10 s 吸光度記 A3,37℃水浴 5min 后,快速取出測(cè)定吸光度記 A4。三、GST 活性計(jì)算:
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1.按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義:在 25℃或者 37℃中,每毫克蛋白每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活性單位。
GST(U/mg prot)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T
=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷Cpr
2.按樣本鮮重計(jì)算
活性單位定義:在 25℃或者 37℃中,每克樣品每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活性單位。
GST(U/g 鮮重)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T
=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷W
3.按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義:在 25℃或者 37℃中,每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活單位。
GST(U/104 cell)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T
=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷500
4.按液體體積計(jì)算
活性單位定義:在 25℃或者 37℃中,每毫升液體每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活單位。
GST(U/mL)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷V 樣÷T
=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)]
ε:產(chǎn)物摩爾消光系數(shù),9.6×103 L/mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;106:1mol=1×106μmol;V 反總:反應(yīng)體系總體積,220μL=2.2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測(cè)定,建議選用本公司生產(chǎn)的 BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒;W :樣品質(zhì)量,g;V 樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02 mL;V 樣總:試劑一體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間(min),5min;500:細(xì)胞數(shù)量, 500 萬(wàn)。
b.使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1)按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義:在 25℃或者 37℃中,每毫克蛋白每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活性單位。
GST(U/mg prot)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T
=0.38×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
活性單位定義:在 25℃或者 37℃中,每克樣品每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活性單位。
GST(U/g 鮮重)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T
=0.38×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷W
(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義:在 25℃或者 37℃中,每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活單位。
GST(U/104 cell)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T
=0.38×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷500
(4)按液體體積計(jì)算
活性單位定義:在 25℃或者 37℃中,每毫升液體每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活單位。
GST(U/mL)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷V 樣÷T
=0.38×[(A4-A3)-(A2-A1)]
ε:產(chǎn)物摩爾消光系數(shù),9.6×103 L/mol /cm;d:96 孔板光徑,0.6cm;106:1mol=1×106μmol;V 反總:反應(yīng)體系總體積,220μL=2.2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測(cè)定,建議選用本公司生產(chǎn)的BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒;W :樣品質(zhì)量;V 樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02 mL;V 樣總:加入試劑一體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間(min),5min;500:細(xì)胞數(shù)量,500 萬(wàn)。
注意事項(xiàng):
1.樣品處理等過(guò)程均需要在冰上進(jìn)行,且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力;
2.細(xì)胞中 GST 活性測(cè)定時(shí),細(xì)胞數(shù)目須在 300 萬(wàn)-500 萬(wàn)之間,細(xì)胞中 GST 的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理,不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞;
3.測(cè)定前先用 1~2 個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn),如 5min 內(nèi)反應(yīng)不成線性,須對(duì)樣品用蒸餾水稀釋?zhuān)?jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù);
4.若樣品測(cè)定吸光度大于 1,建議對(duì)樣品用蒸餾水稀釋?zhuān)?jì)算時(shí)結(jié)果乘以稀釋倍數(shù);
5.測(cè)定反映的溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響,請(qǐng)控制在 25℃或者 37℃(哺乳動(dòng)物)。
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